在體內(nèi)，基底膜是以細(xì)胞為基礎(chǔ)的薄層細(xì)胞外基質(zhì)?？祵?Matrigel matrix 是從富含胞外基質(zhì)蛋白的 EHS 小鼠腫瘤中提取的基底膜基質(zhì)，其中含有約 60%層粘連蛋白、30% IV 膠原和 8%的巢蛋白?？祵?Matrigel matrix 還含有基底膜聚糖、TGF-?、表皮生長(zhǎng)因子、類胰島素生長(zhǎng)因子、組織纖溶酶原及其他生長(zhǎng)因子。

1包被涂層方法：

  康寧基底膜基質(zhì)可以以幾種方式使用。薄層凝膠法適用于在凝膠頂部接種細(xì)胞，厚層凝膠法允許您在三位基質(zhì)內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞，薄層包被法(不凝膠化)給您提供了復(fù)雜的蛋白質(zhì)層，您可以在其上培養(yǎng)細(xì)胞。您的選擇基于您想要實(shí)現(xiàn)的最終結(jié)果，無(wú)論是細(xì)胞生長(zhǎng)、附著還是分化。

  注意：在康寧支持網(wǎng)頁(yè)上發(fā)布了具體的應(yīng)用程序*?？祵幓啄せ|(zhì)產(chǎn)品的蛋白質(zhì)濃度是批次特異的并提供在分析證明書(shū)上。通過(guò)計(jì)算需要的特定蛋白濃度(mg/mL)獲得了稀釋康寧基底膜基質(zhì)產(chǎn)品的一致結(jié)果。為了維持凝膠化的一致性，我們推薦不要將康寧基底膜基質(zhì)稀釋到少于 3 mg/mL。請(qǐng)使用冰冷的無(wú)血清培養(yǎng)基來(lái)稀釋康寧基底膜基質(zhì)。通過(guò)在冰上移液管上下吸液或渦旋小瓶來(lái)混合。

薄層凝膠法

  1. 依照推薦的方法解凍康寧基底膜基質(zhì)。使用預(yù)冷的移液管，將康寧基底膜基質(zhì)混合至均勻。

  2. 將培養(yǎng)板放置在冰上，以 50 μl/cm2向生長(zhǎng)表面加入康寧基底膜基質(zhì)。

  3. 將培養(yǎng)板放置在 37 °C ，30 分鐘。

  4. 如果有必要的話，請(qǐng)?jiān)谑褂脽o(wú)血清培養(yǎng)基輕柔漂洗前吸出未結(jié)合的材料。請(qǐng)確保移液器的吸頭不要刮擦包被的表面。培養(yǎng)板現(xiàn)在可以使用了。

厚層凝膠法

  1.  依照推薦的方法解凍康寧基底膜基質(zhì)。使用預(yù)冷的移液管，將康寧基底膜基質(zhì)混合至均勻。

  2. 將培養(yǎng)板放置在冰上。向康寧基底膜基質(zhì)中加入細(xì)胞并使用預(yù)冷的移液管懸浮。以150-200 μl/cm2向生長(zhǎng)表面加入康寧基底膜基質(zhì)。

  3. 將培養(yǎng)板放置在 37°C，30 分鐘?，F(xiàn)在可以添加培養(yǎng)基了。細(xì)胞也可以培養(yǎng)在這一凝膠的頂部。

薄層包被法

  1. 依照推薦的方法解凍康寧基底膜基質(zhì)。使用預(yù)冷的移液管，將康寧基底膜基質(zhì)混合至均勻。

  2. 使用無(wú)血清培養(yǎng)基將康寧基底膜基質(zhì)稀釋到需要的濃度。對(duì)于您的應(yīng)用程序，您應(yīng)該完成以經(jīng)驗(yàn)為主的研究來(lái)確定您的最適包被濃度。

  3. 向被包被的容器中加入稀釋的康寧基底膜基質(zhì)。加入的量應(yīng)該足以容易地覆蓋整個(gè)生長(zhǎng)表面。在室溫下培養(yǎng) 1 個(gè)小時(shí)。

  4. 吸出未結(jié)合的材料并使用無(wú)血清培養(yǎng)基輕柔地漂洗。培養(yǎng)板現(xiàn)在可以使用了。

細(xì)胞復(fù)蘇：

  康寧中性蛋白酶(貨號(hào) 354235)，康寧細(xì)胞復(fù)蘇溶液(貨號(hào) 354253)。使用康寧細(xì)胞復(fù)蘇溶液在冰上 7 小時(shí)內(nèi)解聚康寧基底膜基質(zhì)能夠?qū)崿F(xiàn)將生長(zhǎng)在康寧基底膜基質(zhì)上的細(xì)胞最有效地復(fù)蘇，或者使用中性蛋白酶，考慮到連續(xù)培養(yǎng)，中性蛋白酶作為一種金屬酶可以分散細(xì)胞。

2注意事項(xiàng)

  因?yàn)榭祵幓啄せ|(zhì)在 10°C 以上會(huì)開(kāi)始凝膠化，所以極其重要的是康寧基底膜基質(zhì)和所有的進(jìn)入與康寧基底膜基質(zhì)接觸的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)基都應(yīng)該預(yù)冷。產(chǎn)品需要放置于冰上，并在 2oC-6oC 的冰箱中或者冷室中過(guò)夜融化，蛋白濃度高時(shí)可能需要更多時(shí)間。操作康寧 Matrigel matrix時(shí)，我們建議使用預(yù)冷的移液管、吸頭和管子。在實(shí)驗(yàn)的全部過(guò)程中請(qǐng)保持康寧基底膜基質(zhì)處于冰上。

3常見(jiàn)問(wèn)題

  康寧高濃度 Matrigel matrix 用于哪些實(shí)驗(yàn)？

康寧高濃度的 Matrigel matrix matrix 可適用于體內(nèi)應(yīng)用研究，如高濃度蛋白可促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。高蛋白濃度同時(shí)可使康寧 Matrigel matrix 注射入小鼠皮下后保持完整，有利于注射的腫瘤細(xì)胞和/或血管生成因子保持原位，便于用于原位分析和/或以后的切除。

如何將康寧 Matrigel matrix 用于 3D 培養(yǎng)？

怎樣制作 3D 膠？

需要將細(xì)胞嵌入到康寧 Matrigel matrix 中嗎？

康寧高濃度的 Matrigel matrix 可適用于體內(nèi)應(yīng)用研究，如制備厚層包被用于 3D 細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞可以嵌在康寧 Matrigel matrix 中或者接種在康寧 Matrigel matrix 表面（覆蓋法）。

使用 Corning Matrigel matrix 時(shí)，需要將移液器吸頭和離心管預(yù)冷嗎？

是的。因?yàn)?Corning Matrigel matrix 在高于 10℃的條件下即會(huì)開(kāi)始成膠，我們推薦操作 Matrigel matrix 時(shí)使用預(yù)冷的移液管、吸頭和離心管。

Corning Matrigel matrix 會(huì)快速聚合嗎？

Corning Matrigel matrix 在 22℃至 35℃時(shí)會(huì)快速聚合成膠。

什么情況下，需要使用無(wú)酚紅 Corning Matrigel matrix？

對(duì)于涉及顏色檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)，推薦使用無(wú)酚紅 Corning Matrigel matrix，如使用熒光染料或 Drabkins 法計(jì)數(shù)內(nèi)皮細(xì)胞成管實(shí)驗(yàn)。對(duì)于子宮內(nèi)膜細(xì)胞培養(yǎng)，也需使用無(wú)酚紅 Corning Matrigel matrix。

此外，酚紅和非甾體雌激素結(jié)構(gòu)類似，有類雌激素效應(yīng)。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)可能具有干擾內(nèi)分泌和荷爾蒙代謝的能力。

如何從 Corning Matrigel matrix 中收獲細(xì)胞？

推薦使用 Corning Dispase 或 Corning Cell Recovery Solution 來(lái)收獲培養(yǎng)在Matrigel matrix 中的細(xì)胞。

Corning Dispase 相比胰酶、膠原酶或其他蛋白水解酶能夠更溫和有效地獲得單細(xì)胞懸液，不會(huì)損傷細(xì)胞或細(xì)胞表面蛋白。對(duì)于需要繼續(xù)接種培養(yǎng)或進(jìn)行檢測(cè)的細(xì)胞，使用 Corning Dispase 不會(huì)產(chǎn)生損傷。此外，Corning Dispase 也可以用于組織分離。

對(duì)于代謝研究和 RNA 抽提，建議在 4℃使用 Corning Cell Recovery Solution 進(jìn)行非酶反應(yīng)的細(xì)胞收獲。因?yàn)?Corning Matrigel matrix 中含有痕量的 RNA，進(jìn)行RNA 分析時(shí)，應(yīng)設(shè)一個(gè) Corning Matrigel matrix（不接種細(xì)胞）的對(duì)照組。

其它從 Corning Matrigel matrix 中收獲細(xì)胞的方法：

降低溫度至 4℃ - 6℃使 Matrigel matrix 解聚，需要一定的時(shí)間并且僅適合一部分應(yīng)用。

離心以破壞 Corning Matrigel matrix 結(jié)構(gòu)。

1. Corning? Matrigel? matrix包被過(guò)的培養(yǎng)皿可以儲(chǔ)存多長(zhǎng)時(shí)間呢？

包被過(guò)的培養(yǎng)皿最好當(dāng)天使用，具體情況取決于實(shí)驗(yàn)?zāi)康?。需要保存的情況下，可在37°C培養(yǎng)箱中最多存放7天。保存時(shí)Matrigel表面需要使用無(wú)血清培養(yǎng)基均勻覆蓋，保持濕潤(rùn)。

2.  如何確定Corning? Matrigel? matrix的包被用量？

*其他常用培養(yǎng)器皿的有效培養(yǎng)面積可查看www.corning.com/lifescience

3. 哪些情況下應(yīng)該選用薄膠？什么時(shí)候用厚膠呢？ 3D培養(yǎng)有哪些應(yīng)用？

薄膠主要用于輔助細(xì)胞貼壁，有利于細(xì)胞增殖。如原代細(xì)胞培養(yǎng)，需要一層薄薄的蛋白層輔助，就可以選用薄膠；厚膠主要用于3D細(xì)胞培養(yǎng)，如大鼠主動(dòng)脈組織分化為毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)（Ring Assay），以及進(jìn)行細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)等；3D細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，主要是用于研究細(xì)胞與細(xì)胞間的相互作用以及復(fù)雜結(jié)構(gòu)，如生物組織等。

詳細(xì)信息請(qǐng)參閱Corning? Matrigel? matrix使用指導(dǎo)手冊(cè)。

4. 進(jìn)行內(nèi)皮管形成實(shí)驗(yàn)，應(yīng)該選用多大濃度的Matrigel呢？

進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)，Matrigel最低濃度應(yīng)不低于10mg/mL。

5. 所有的Corning? Matrigel? matrix 都可以用于人胚胎干細(xì)胞（hESC） 培養(yǎng)嗎?

不是的。Corning提供專門(mén)用于人胚胎干細(xì)胞（hESC）培養(yǎng)的Corning? Matrigel? matrix（貨號(hào)為 354277）。該產(chǎn)品生產(chǎn)過(guò)程中經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的質(zhì)量監(jiān)控，可以保證hESC培養(yǎng)的一致性、可重復(fù)性和高度可靠性。在干細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域知名的STEMCELL Technologies公司，也正是選用此產(chǎn)品包被的培養(yǎng)板，用于生產(chǎn)其mTeSR?1產(chǎn)品。hESC在mTeSR1培養(yǎng)體系中可以維持未分化狀態(tài)，保持標(biāo)準(zhǔn)形態(tài)并正常表達(dá)表面標(biāo)志物。

此外，Corning BioCoat? Matrigel matrix提供預(yù)包被產(chǎn)品，如預(yù)包被的6孔板（貨號(hào)354671）。該系列產(chǎn)品不同批次間的Matrigel包被濃度一致，方便用戶使用；用于hESC培養(yǎng)，可以維持干細(xì)胞應(yīng)有的自我更新能力和多能性。如果使用非專門(mén)用于hESC培養(yǎng)的Corning? Matrigel? matrix培養(yǎng)hESC，細(xì)胞培養(yǎng)效果可能不理想，不推薦用戶使用。

6. 做細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)，需要使用多少Corning? Matrigel? matrix進(jìn)行包被？

包被24孔通透性支持物，推薦每孔使用0.1 mL (濃度200-300 μg/mL) ，Corning?Matrigel? matrix貨號(hào)為354234, 354230 。

7. Corning? Matrigel? matrix的最低成膠濃度是多少？

不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康男枰煌腗atrigel濃度，用戶應(yīng)該根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)需求確定。Corning?Matrigel? matrix最低成膠濃度為 3 mg/mL。稀釋時(shí)不要簡(jiǎn)單進(jìn)行體積倍比稀釋，不同批次間的Matrigel濃度有差異，應(yīng)該根據(jù)最終工作濃度 (mg/mL)算出需要加入的稀釋液體（如PBS或無(wú)血清培養(yǎng)基）的量。用于體內(nèi)研究的Matrigel，為了避免成膠不完全，最終工作濃度不應(yīng)低于 4 mg/mL。

8. Corning? Matrigel? matrix膠塊在體內(nèi)可以維持多長(zhǎng)時(shí)間？

基質(zhì)膠膠塊可以在體內(nèi)維持至少一周的時(shí)間。

9. 怎樣稀釋Corning? Matrigel? matrix?

使用冰上預(yù)冷的無(wú)血清培養(yǎng)基或者PH 7.4的PBS。

10. 應(yīng)該如何對(duì)Corning? Matrigel? matrix移液操作?

推薦使用預(yù)冷的移液器或者注射器操作，移液管、槍頭同樣需要預(yù)冷。吸液時(shí)不要觸及瓶子底部；分液時(shí)切忌過(guò)快、用力過(guò)猛。如果使用移液管（Pipets），需要分液5mL時(shí)，應(yīng)該吸取6mL，分液到移液管內(nèi)仍有1mL時(shí)即停止；如果使用自動(dòng)移液器（Pipetman），按壓到第二檔位吸液，然后按壓到第一檔位進(jìn)行分液。

11. 為什么我的Corning? Matrigel? matrix很粘稠？

基質(zhì)膠的蛋白濃度越高，膠體越粘稠。如果濃度高于13.0 mg/mL，基質(zhì)膠會(huì)顯得非常厚重。Corning? Matrigel? matrix基質(zhì)膠產(chǎn)品在未稀釋前都會(huì)比較粘稠。粘稠的高濃度Corning? Matrigel? matrix(Corning? Matrigel? matrix HC)不稀釋也可以直接使用，如用于培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞和/或血管生成因子，注射于小鼠體內(nèi)后，細(xì)胞可以保持原位，便于原位分析和/或以后的切除；或者稀釋后，按照標(biāo)準(zhǔn)濃度的Corning? Matrigel?matrix產(chǎn)品使用方法使用，具體稀釋濃度根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求確定。

除因?yàn)楫a(chǎn)品本身濃度高而粘稠外，基質(zhì)膠的狀態(tài)還與運(yùn)輸過(guò)程中溫度的變化和儲(chǔ)藏條件有關(guān)。整個(gè)運(yùn)輸過(guò)程中必須使用干冰冷藏。如果儲(chǔ)藏Corning? Matrigel? matrix的冰箱帶有自動(dòng)除霜功能，冰箱除霜過(guò)程中升溫，可能使基質(zhì)膠成膠。所以，切忌將Corning?Matrigel? matrix儲(chǔ)藏于此類冰箱中。為保證Corning? Matrigel? matrix的使用效果，凍融次數(shù)應(yīng)該盡可能減少。拿到新的Corning? Matrigel? matrix后，請(qǐng)按照單次用量進(jìn)行分裝。每次融化操作，Matrigel基質(zhì)膠都應(yīng)該放置于冰上。如果Matrigel基質(zhì)膠在成膠狀態(tài)被凍住，再次融化時(shí)將不能成恢復(fù)液體。

12. Corning? Matrigel? matrix可以誘導(dǎo)ES/iPS細(xì)胞分化嗎？

可以的，已經(jīng)有相關(guān)文章表明 Corning? Matrigel? matrix可以用于ES/iPS細(xì)胞的分化研究。

13. 為什么Corning? Matrigel? matrix在37°C成膠，而在4°C時(shí)卻呈液體狀態(tài)？

Corning? Matrigel? matrix是一種從小鼠骨肉瘤中提取的重組基底膜， 新鮮提取的原料中主要包括以下成分：層粘連蛋白，IV型膠原, 巢蛋白，基底膜聚糖、表皮生長(zhǎng)因子、類胰島素生長(zhǎng)因子及其他生長(zhǎng)因子。這些蛋白構(gòu)成了Matrigel的基本結(jié)構(gòu)。在22℃-37℃溫度條件下，大分子間的共價(jià)鍵可以結(jié)合，促使Matrigel形成凝膠。而在低溫條件（如4℃）下，由于沒(méi)有足夠的能量促使共價(jià)鍵結(jié)合，所以Matrigel呈現(xiàn)液體狀態(tài)。

14. Corning? Matrigel? matrix可以反復(fù)凍融嗎？

建議用戶第一次融化后按照單次用量進(jìn)行分裝，保存。

15. 為什么細(xì)胞沒(méi)有貼壁？Matrigel 也脫落了？

首先需要檢查細(xì)胞的接種濃度是否過(guò)高，Corning Matrigel的用量應(yīng)等同于細(xì)胞培養(yǎng)體系中培養(yǎng)基的用量。如果Corning? Matrigel? matrix被稀釋到過(guò)低的濃度，形成的膠體容易從組織培養(yǎng)器皿表面分離。

16. 未稀釋的Corning? Matrigel? matrix中出現(xiàn)的沉淀應(yīng)該怎么樣處理？

4°C下低速離心，去除沉淀物 。

17. 未使用完的Corning? Matrigel? matrix應(yīng)該怎樣保存的？

與細(xì)胞培養(yǎng)基或緩沖液混合過(guò)但未使用完的Corning? Matrigel? matrix，不建議保留再用。

18. Corning? Matrigel? matrix中含有 DNA和/或RNA嗎?

是的。Corning? Matrigel? matrix沒(méi)有經(jīng)過(guò)DNA酶或RNA酶消化處理，可能會(huì)含有痕量的DNA、RNA。

19. Corning? Matrigel? matrix中有血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和金屬蛋白酶（MMPs）嗎?

在標(biāo)準(zhǔn)濃度的Corning? Matrigel? matrix中含有 5.0-7.5 ng/mL 的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（ VEGF），GFR Corning? Matrigel? matrix中VEGF含量為1.0-1.5 ng/mL。另外，可能含有老鼠腫瘤細(xì)胞來(lái)源的痕量金屬蛋白酶（MMPs）。

20. Corning? Matrigel? matrix中有 LDEV嗎?

沒(méi)有的。Corning? Matrigel? matrix經(jīng)免疫方法及PCR方法檢測(cè)，并不含有乳酸脫氫酶增高病毒（LDEV）或者乳酸脫氫脢增生病毒（LDHV） 。此外，我們還針對(duì)小鼠群體及腫瘤來(lái)源篩查了其他種類的病毒。詳細(xì)信息請(qǐng)參見(jiàn)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。

21. Corning? Matrigel? matrix中有尿素嗎?

沒(méi)有的。在Corning? Matrigel? matrix生產(chǎn)準(zhǔn)備過(guò)程中使用過(guò)尿素，后續(xù)流程中經(jīng)過(guò)透析方法已經(jīng)去除了。

22. Corning? Matrigel? matrix中使用的什么緩沖液？

低葡聚糖 DMEM (1g/L)，其中包含 50 μg/mL 慶大霉素。

23. Corning? Matrigel? matrix 中含有纖維連接蛋白（Fibronectin）嗎？

是的，通過(guò)使用Western Blot檢驗(yàn)，我們?cè)贛atrigel matrix中發(fā)現(xiàn)了微量的纖維連接蛋白（Fibronectin）

24. Corning? Matrigel? matrix 中含有玻璃體結(jié)合蛋白（ vitronectin）嗎?

某些EHS組織中可能含有微量的血液，因此Corning? Matrigel? matrix中可能會(huì)有痕量的玻璃體結(jié)合蛋白（Vitronectin） 。

25. Corning? Matrigel? matrix 中還有什么別的物質(zhì)？

Corning? Matrigel? matrix 中還可能含有濃度小于 0.02%的三氯甲烷，以及腫瘤細(xì)胞的產(chǎn)生的其他未知蛋白或分子。

26. 提取過(guò)程會(huì)引起層粘連蛋白變性嗎？

不會(huì)的，不會(huì)引起層粘連蛋白變性。

27. Corning? Matrigel? matrix 可以儲(chǔ)存在 -70℃嗎？

是的。Matrigel matrix 可以儲(chǔ)存在-70℃。建議客戶將整瓶的 Matrigel matrix 進(jìn)行分裝，儲(chǔ)存于聚丙烯或其他可以耐受超低溫條件材質(zhì)的小管中，方便保存和使用。

28. Corning? Matrigel? matrix 的折射率是多少？

20°C 條件下，Corning? Matrigel? matrix 的折射率是 1.3406 到 1.3407，相對(duì)折射率為1.0056（同等條件下，水的折射率為 1.333）。

29. Corning? Matrigel? matrix 會(huì)有自發(fā)熒光嗎？

Corning? Matrigel? matrix 是一種蛋白混合物，經(jīng)過(guò)透析處理后溶解在 DMEM 培養(yǎng)基中。為防止微生物污染，培養(yǎng)基中添加了慶大霉素。所以 Corning? Matrigel?matrix 可能引發(fā)熒光的組分包括其中的蛋白質(zhì)成分，維生素成分以及慶大霉素（氨基糖苷類抗生素）。如果需要使用熒光檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，建議使用者建立對(duì)照實(shí)驗(yàn)，在所需要的波長(zhǎng)條件下進(jìn)行對(duì)比，以便排除背景熒光。

30. 使用 Matrigel 培養(yǎng)的細(xì)胞，如果需要進(jìn)行切片或者免疫組織化學(xué)及免疫熒光檢驗(yàn)，該怎樣固定呢？如何避免解聚？

可以使用 2%濃度的多聚甲醛進(jìn)行固定。為避免固定后出現(xiàn)解聚的情況，可以加入 1%濃度的戊二醛。戊二醛作為固定劑，常用于電鏡觀察。如果用戶需要進(jìn)行免疫熒光檢驗(yàn)，加入戊二醛后，會(huì)出現(xiàn)明顯的背景熒光。為了解決這一問(wèn)題，我們建議用戶在固定之后，使用 NaBH4 進(jìn)行淬滅。NaBH4 極易氣泡，進(jìn)行該步驟時(shí)，必須在水平操作臺(tái)上小心操作，避免晃動(dòng)，盡量減少氣泡的形成。另外，用戶也可以嘗試使用較低濃度的戊二醛進(jìn)行固定，如 0.1%到 0.5%，濃度越低，背景熒光信號(hào)越少。